半纤维素是一系列线性的或带支链的异型多聚糖，包括己糖(如葡萄糖，甘露糖和半乳糖)，戊糖(如木糖和阿拉伯糖)以及糖酸[1]。软木和硬木中的半纤维素分别主要为甘露聚糖和木聚糖[2]。β-甘露聚糖的主链是由β-1,4-糖苷键连接而成的D-吡喃甘露糖(或甘露糖和葡萄糖的混合物)，还有可能含有由α-1,6-糖苷键连接的半乳糖支链[3]。存在于软木中的甘露聚糖主要为半乳葡萄甘露聚糖，其含有甘露糖，葡萄糖和半乳糖残基的比例为3：1：1；而硬木中的甘露聚糖主要为葡甘露聚糖，其中甘露糖和葡萄糖残基的比例通常为3：1[4]。甘露聚糖的彻底水解需要几种酶的共同协作才可以完成。首先，外切β-1,4-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)将β-1,4-糖苷键连接而成的甘露糖主链降解[5]；然后由此释放出的甘露寡糖再由β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)和乙酰甘露聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)进一步地水解成甘露糖[6]。β-甘露聚糖酶是水解甘露糖和异聚甘露醇中β-1,4-D-甘露糖苷键的关键酶，并由此释放出低聚甘露糖。根据氨基酸序列和疏水集团聚类分析，可以将大多数β-葡萄糖苷酶归类到糖苷水解酶家族5、26和113[3]。内切β-1,4-甘露聚糖酶在基础研究，生物材料转化和各种工业应用中都能发挥重要的作用，如软木纸浆的漂白，食品及饲料添加剂和开采石油等[7, 8, 9]。在造纸工业中，内切β-1,4-甘露聚糖酶与木聚糖酶协同作用，可以提高纸浆的亮度[10]。在动物饲养中，内切β-1,4-甘露聚糖酶可以减少饲料中的抗营养因子——甘露聚糖聚合物[11]。β-甘露聚糖酶还可以应用于处理即溶咖啡时的咖啡废物回收。 日益增长的对可再生资源重复利用的需求，使得β-甘露聚糖酶吸引了众多工业领域的目光[12, 13]。近几年，已有人报道过利用重组大肠杆菌生产甘露聚糖酶[14, 15, 16]。而对于将甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中表达的报道很少。这也是由于利用枯草芽胞杆菌作为宿主菌有一定的限制性：(1)枯草芽孢杆菌自身产生的分泌蛋白可以识别并降解异源重组蛋白；(2)重组的枯草芽孢杆菌表达系统具有不稳定性[17]。以上这些障碍可以通过构建蛋白质缺陷菌株和导入Theta型复制质粒来克服。 我们曾经通过富集培养的方法从臭豆腐卤液中筛选出六株菌株[18]，其中有一株具备高甘露聚糖水解能力的短小芽孢杆菌Nsic-2。在本研究中，我们从短小芽孢杆菌Nsic-2中克隆得到β-甘露聚糖酶基因，在大肠杆菌中进行了表达，得到酶活较高的β-甘露聚糖酶。还进一步研究了其酶活特性，包括酶的稳定性，最适反应温度，最适反应pH等。并且，在枯草芽孢杆菌表达系统中，利用可诱导的启动子Pgrac，实现了β-甘露聚糖酶的分泌表达。这是对来源于短小芽孢杆菌的甘露聚糖酶及其酶活特性的首次报道。并且，所得的甘露聚糖酶的两个重要特性(碱性条件下的稳定性和在枯草芽胞杆菌中分泌表达)，都显示了其潜在的研究价值。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒： 本研究中用到的菌株和质粒详细信息见表1。 1.1.2 主要试剂与仪器： 本研究用到的细菌基因组提取试剂盒，细菌质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自于Axygen公司。TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit，T4 DNA ligase，DNA marker，Taq DNA Polymerase和BamH I等限制性内切酶均购自于大连宝生物公司。Protein marker购于Fermentas公司。IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素购于Amresco公司。商品甘露聚糖酶ECONASE MP 1000由里氏木霉分泌。角豆胶购于Sigma公司。电热恒温培养箱购于上海跃进医疗器械厂。核酸电泳仪购于北京六一仪器厂。恒温摇床购于华利达公司。PCR仪购于Eppendorf公司。凝胶成像系统购于SYNGENE公司。pH计购于上海雷磁仪器厂。 1.1.3 引物与培养基： 本研究中所用的引物及其序列见表2。引物设计使用Primer Premier 5.0软件。引物于生工生物工程股份有限公司(上海)合成。 LB培养基的成分包括：1%的氯化钠，1%的胰蛋白胨，0.5%的酵母粉，用去离子水配制，于121 ℃高压灭菌20 min。 1.2 β-甘露聚糖酶的基因克隆 首先，将短小芽孢杆菌Nsic-2于LB培养基中过夜培养。第二天取适量菌液，用Axygen AxyPrep 细菌基因组DNA小量试剂盒提取其基因组DNA。 接着，基于GenBank数据库中四种来源于典型芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶基因保守序列(图1)，设计简并引物man-U1/man-D1，扩增得到Nsic-2中甘露聚糖酶基因的部分序列。扩增条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃40 s，30个循环；72 ℃10 min。扩增产物于华大基因进行测序。 然后，通过染色体步移和巢式PCR，用TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit扩增得到完整的β-甘露聚糖酶基因序列(manB)，并进行测序。PCR扩增条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃ 80 s，30个循环；72 ℃10 min。将扩增产物与pMD19-T simple vector于16 ℃下过夜连接，得到质粒 pMD-manB，并转化到感受态的大肠杆菌DH5α中。 1.3 β-甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化 以Nsic-2的基因组DNA为模板，分别用三对引物pET28-man-U/pET28-man-D，pET32-man-U/pET32-man-D和pET42-man-U/pET42-man-D扩增manB基因。扩增产物分别与载体pET-28a，pET-32a和pET-42a进行重组(图2)。重组质粒转化到感受态的大肠杆菌BL21中。大肠杆菌的制备和质粒转化方法参见分子克隆实验指南第三版[19]。重组菌(BL21-pET-28a-manB，BL21-pET-32a-manB和BL21-pET-42a-manB)在含有适当浓度抗生素(浓度为50 μg/mL的卡那霉素或100 μg/mL的氨苄青霉素)的LB培养基中进行过夜培养。培养至适当菌液浓度(OD600≈0.5)时，在20 ℃条件下用0.1 mmol/L的IPTG诱导培养16 h。 诱导培养后收集菌体，进行SDS-PAGE分析。剩余全部菌体进行超声破碎并用镍柱纯化系统Ni-NTA Purification System进行纯化[20]。纯酶用Bradford法测定酶蛋白的浓度。 1.4 β-甘露聚糖酶活性测定 利用3,5-二硝基水杨酸法(即DNS法)来测定β-甘露聚糖酶(ManB)的活性。首先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液配制浓度为5 g/L的角豆胶溶液(pH7.0)。取900 μL角豆胶溶液与100 μL适当稀释的酶液混合，于40 ℃孵育10 min，孵育后立即以0.5 mL DNS试剂终止反应。然后，将混合液于沸水浴中孵育10 min，流动水下迅速冷却至室温。最后在分光光度计波长540 nm下，测定混合液的光密度。本实验设3次平行实验。空白对照的反应体系中只有900 μL角豆胶溶液，用DNS处理后再加入100 μL适当稀释的酶液。酶活单位用U表示。1 U定义为在40 ℃条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量。 1.5 酶学性质的研究 对纯化后的酶进行酶学性质的研究。β-甘露聚糖酶的最适反应温度是在pH7.0的条件下测定的，分别测定其在30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃下反应的酶活。最适反应pH是在40 ℃的条件下测定的，分别测定其在不同pH值(2.0-10.0)的缓冲液中反应的酶活。热稳定性是将酶于不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃)下，分别保温15、30、60和90 min后，在pH7.0的条件下测定其残余酶活。pH稳定性是在40 ℃条件下，将酶预先在不同pH的缓冲液中保温30 min后，测定其残余酶活。热稳定性和pH稳定性的测定均以初始酶活为100%，测定其保温后的相对酶活。金属离子和化学试剂对酶活的影响是在40 ℃条件下测定的。在反应体系中分别加入不同浓度的相应试剂，利用DNS法测定酶活。实验中以没有添加任何金属离子和化学试剂的反应体系为空白对照。此外，还测定了β-甘露聚糖酶对蛋白酶的抵抗力。将β-甘露聚糖酶分别与胃蛋白酶(pH2.0，10 μg/mL，以100 mmol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液配制)，胰蛋白酶(pH7.0，10 μg/mL，以100 mmol/L的磷酸盐缓冲液配制)和蛋白酶K(pH7.0，10 μg/mL，以100 mmol/L的磷酸盐缓冲液配制)于37 ℃反应2 h，用DNS法测定其反应酶活。以未加入蛋白酶的反应体系为空白对照。上述实验均重复3次，每次均设3个平行样品。3次测定的平均值作为最终酶活。 1.6 β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 以Nsic-2的基因组DNA为模板，利用引物pHT43-man-U/pHT43-man-D扩增manB基因，与pHT43载体(含有可诱导启动子Pgrac)进行重组，得到重组质粒pHT43-manB(图2)，并转化到感受态的枯草芽孢杆菌WB800N中。重组菌株(WB800N-pHT43-manB)于37 ℃下，在含有15 μg/mL氯霉素的LB培养基中过夜培养。培养至适当菌液浓度(OD600≈0.5)时，在37 ℃条件下用0.1 mmol/L的IPTG诱导培养24 h。诱导培养后收集菌液，进行SDS-PAGE分析。 2 结果和分析 2.1 manB基因克隆与序列分析 利用简并引物man-U1/man-D1扩增得到一段长度为250 bp的基因片段，其序列与短小芽孢杆菌(CCAM080065)来源的GH 26 β-1,4-mannanase相似度很高。通过巢式PCR和染色体步移，扩增得到一段长度为1421 bp的基因片段。对基因序列(manB，GenBank accession number：KC436314)进行分析，其序列含有一个1104 bp的开放阅读框，编码367个氨基酸，起始密码子为ATG，推测有一个核糖体结合位点(AAGGAA)，GC含量为42%。经SignalP Server推测，其蛋白序列N末端有一段31个氨基酸的信号肽且第31个和32个氨基酸之间为信号肽酶切位点(图3-A)。经BLASTp预测其蛋白含有一个糖苷水解酶家族26的催化区域。系统发育树(图4)显示其氨基酸序列与短小芽孢杆菌 CCAM080065(AEO79931.1)和枯草芽孢杆菌WY34 (ADW78259.1)来源的甘露聚糖酶氨基酸序列非常相近。经ExPASy预测，蛋白ManB的分子量约为41.5 kDa，pI值为6.0。我们推测序列比对中保守的氨基酸区域可能与蛋白的稳定性及催化功能相关。利用SWISS-MODEL server预测ManB的三维结构，发现其催化区域有一个(β/α)8-barrel折叠，这是糖苷水解酶家族26蛋白中的保守结构(图3-B)。B. subtilis Z-2来源的甘露聚糖酶催化谷氨酸残基(Glu167和Glu266)[14]与ManB的催化谷氨酸残基(Glu198和Glu297)如图3-B所示。 2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化 本研究中，利用大肠杆菌表达载体pET-28a，pET-32a和pET-42a来表达外源蛋白。将重组质粒pET-28a-manB，pET-32a-manB和pET-42a-manB转化到大肠杆菌 BL21(DE3)/pLys中，以获得重组蛋白(ManB)。若将manB在不同的温度下诱导表达，以BL21-pET-28a-manB重组菌株为例，将其在37 ℃下诱导表达时，无法检测到甘露聚糖酶活性，重组蛋白几乎表现为包涵体；在30 ℃下诱导表达时，可以检测到微量的甘露聚糖酶活性(图5-B)。若将其在20 ℃下诱导培养2 h，则在菌体裂解液的上清中可以明显检测到甘露聚糖酶活性。若将诱导时间延长至6 h，菌体裂解液上清中甘露聚糖酶活性可达 318.6 U/mL。当诱导时间延长至16 h，菌体裂解液上清中的甘露聚糖酶酶活可达最高值，为11021.3 U/mL。而将没有整合有manB基因的pET空载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pLys中进行表达，是无法检测到甘露聚糖酶活性的。没有经IPTG诱导的重组菌株经培养后，也无法检测到甘露聚糖酶活性。由此证明，甘露聚糖酶基因成功地在大肠杆菌中获得了表达。 将ManB进行SDS-PAGE分析，如图5所示，所得重组蛋白大小与预测的ManB大小十分相近(图5-A)。由于载体pET-32a中融合有一个109个氨基酸的硫氧还蛋白标签，所以重组菌株BL21-pET-32a-manB表达的重组蛋白ManB与其它两株重组菌相比，分子量较大，约为54 kDa。 经DNS法测定，3种重组菌株BL21-pET-28a-manB，BL21-pET-32a-manB和 BL21-pET-42a-manB所表达的甘露聚糖酶酶活分别为11021.3 U/mL，4524.3 U/mL和6539.9 U/mL。将50 mL重组菌株pET-28a-manB表达的重组蛋白经镍柱纯化，测得纯酶比活为4191.3 U/mg。与粗酶液相比，纯化得率为5.4%，纯度提高27倍。纯酶液经SDS-PAGE分析，可以看到分子量大小与预测相一致的单一条带(约42.0 kDa)(图5-B)。 2.3 纯化后的重组甘露聚糖酶酶学性质 由于BL21-pET-28a-manB表达的甘露聚糖酶酶活最高，所以我们以它表达的重组蛋白为例，研究其纯酶的酶学特性。 如图6所示，纯化后的蛋白ManB在pH6.0条件下酶活最高，且在pH6.0-9.0之间酶活较高，仍能保留最高酶活75%以上的活性。在pH6.0-8.0之间，其酶活表现出高度的稳定性。ManB的最适反应温度为40 ℃。将其在40 ℃孵育1 h后，仍能保留初始酶活的90%以上。将其在70 ℃孵育90 min，其酶活几乎为零。 不同的金属离子或化学试剂对酶活的影响见表3。浓度较低(1 mmol/L)的金属离子，Mg2+、 K+、Ni2+和Co2+对酶活稍有抑制或没有影响，Zn2+可以稍微提高酶活。当金属离子浓度较高时(5 mmol/L和10 mmol/L)，Mg2+可以明显地抑制酶活。不同浓度(1 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L)的Ca2+和Mn2+都可以提高酶的活性。浓度为10 mmol/L的Cu2+、Ni2+和Co2+都可以严重地降低酶的活性。异丙醇、吐温-80、吐温-20和TritonX-100对酶活没有明显影响。SDS可以完全地抑制酶活性。还原剂DTT可将酶活提高为原来的154%。甲醇和二甲基亚砜可以强烈抑制酶活。 如表4所示，ManB对几种中性蛋白酶都表现出强烈的抗性。将其分别与胰蛋白酶和蛋白酶K于pH7.0下孵育2 h后，仍能保留初始酶活的95.4%和66.1%。然而，将其与胃蛋白酶于pH2.0下孵育2 h后，其酶活几乎为零。 通过改变底物角豆胶的浓度，利用Lineweaver Burk双倒数法(图7)，测定ManB的酶反应动力学参数Km和Vmax分别为35.7 mg/mL和14.9 μmol/(mL·min)。 2.4 manB在枯草芽孢杆菌中的表达 与大肠杆菌表达系统相比，枯草芽胞杆菌表达系统可以有效地将重组蛋白分泌到细胞外。 我们利用大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pHT43，将manB在枯草芽孢杆菌中表达。载体pHT43的强启动子Pgrac由启动子groESL与其下游的乳糖操纵子融合而成，使其可以通过IPTG来诱导蛋白的表达。将manB基因整合于Pgrac的下游，并在枯草芽胞杆菌WB800N中进行表达。IPTG诱导表达24 h后，菌体裂解液中甘露聚糖酶酶活可达413.3 U/mL，而培养液上清中甘露聚糖酶酶活可达389.3 U/mL，约为总酶活的94%。在未经IPTG诱导的培养液或携带pHT43空载体的枯草芽胞杆菌WB800N培养液中，无法检测到甘露聚糖酶酶活。可以证明，甘露聚糖酶成功地在枯草芽胞杆菌WB800N中得到表达。重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为42 kDa，与预测大小相一致(图5-C)。 3 讨论 臭豆腐是大家熟知的中国传统发酵食物。之前有文献报道过，臭豆腐在发酵过程中会产生氨气，导致pH升至8.0到9.0之间，属于碱性发酵。芽孢杆菌通常会参与臭豆腐的发酵[6]。本文中，从臭豆腐卤液中分离出一株具有强甘露聚糖水解能力短小芽孢杆菌Nsic-2，将Nsic-2中编码甘露聚糖酶的基因克隆出来，成功地在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行了表达，且重组蛋白的酶活相对于原宿主短小芽孢杆菌发酵液的甘露聚糖酶酶活(10.2 U/mL)均有明显提高。在枯草芽孢杆菌表达系统中，甘露聚糖酶可以分泌表达，但表达水平和酶活却远低于其在大肠杆菌中的表达。我们以前报道的将manB于枯草芽孢杆菌中表达，也同样检测到较低的酶活[21]。鉴于重组菌 BL21-pET-28a-manB中甘露聚糖酶酶活最高，我们以此为例来研究酶学性质。 目前，已有一些文献报道过不同芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶的性质(表5)，包括环状芽孢杆菌[22, 31]，地衣芽孢杆菌[16]，枯草芽孢杆菌[12, 15, 23, 24, 30, 32, 33]和嗜热脂肪芽孢杆菌[25]。它们的酶活(从4.9到8300 U/mg)，最适反应pH，最适反应温度和酶反应动力学参数都明显不同。由于检测甘露聚糖酶活性时常用的底物角豆胶具有粘稠的特性，难于配制，有人推测一些报道中酶活差异大有一部分是由配制底物的方法不同引起的[16]。 但对于短小芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶的重组表达及酶学性质的详细描述，还无人报道。重组菌 BL21-pET-28a-manB表达的甘露聚糖酶纯化后，测定其最适反应温度为40 ℃，与之前报道过的芽孢杆菌M50[26]和B36[23]相似，比环状芽孢杆菌NT 6.7(50 ℃)[31]，枯草芽孢杆菌B23(50 ℃)[34]，嗜热脂肪芽孢杆菌[25]和类芽孢杆菌BME-14[27]低(60 ℃)，比多粘类芽孢杆菌稍高(37 ℃)[28]。其热稳定性与来源于多粘类芽孢杆菌[29]，芽孢杆菌M50[26]和WY34[12]中的甘露聚糖酶(＜50 ℃)相似。ManB的最适反应pH为6.0，与芽孢杆菌WY34[12]，环状芽孢杆菌NT 6.7[31]，芽孢杆菌 BS5[32]和芽孢杆菌MAFIC-S11[33]来源的甘露聚糖酶相似。与其它的芽孢杆菌甘露聚糖酶差异较大。如芽孢杆菌Z-2来源的甘露聚糖酶最适反应pH为4.0[30]，芽孢杆菌B36来源的为6.4[23]，芽孢杆菌JAMB-750来源的为10.0[35]。 酶的性质决定了它的应用价值，而最适反应pH是其应用的关键影响因素。通常情况下，酸性甘露聚糖酶主要应用于食品和饲料工业中，而中性和碱性甘露聚糖酶主要应用于咖啡萃取，石油钻探，洗涤剂，纺织品和纸浆工业中[36]。在以前的报道中，细菌，放线菌和真菌来源的甘露聚糖酶最适pH在酸性到中性之间，如来源于芽孢杆菌SA-22的甘露聚糖酶(6.5)[37]，来源于类芽孢杆菌BME-14(4.5)[27]，来源于解凝乳类芽胞杆菌(4.0)[24]，来源于环状芽孢杆菌NT 6.7[31]。通常，真菌来源的甘露聚糖酶在酸性到中性pH范围内比较稳定，如来源于草酸青霉菌GZ-2的甘露聚糖酶(4.0)[38]。也有少数报道真菌甘露聚糖酶当pH升至8.5时酶活也能保持稳定。对于如纸浆生产这种需要酶在碱性条件下发挥作用的工业中，最适pH在酸性到中性之间的甘露聚糖酶的应用就受到了很大的限制。我们表达的甘露聚糖酶ManB在pH6.0到9.0之间酶活稳定，可以保留最大酶活的70％以上。即使pH升至10.0，其还可以保留最大酶活的40％左右。这个特性使其在很多工业应用中具有很好的应用价值。 我们的数据表明，DTT可以明显地提高ManB的活性，而Cu2+可以明显地降低其活性。由于重金属离子可以与硫氢根离子结合，形成硫醇盐。由此可以推测在ManB的活性位点上可能有硫氢根离子。而DTT可以将蛋白中的硫氢根基团进行还原。由此可以进一步证明ManB的活性位点中有硫氢根基团。 很多文献报道过甘露聚糖酶在大肠杆菌中表达[14, 15, 16]，却少有甘露聚糖酶于枯草芽孢杆菌中表达的报道。同时，由于基因manB来源于芽孢杆菌，在淀粉酶信号肽的作用下，我们利用枯草芽孢杆菌表达载体来分泌表达外源蛋白。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌不会分泌毒素，没有致病性，被公认为安全无毒的微生物。它的蛋白质分泌机制可以将重组蛋白直接分泌到发酵液中，还具有易于基因操作，周期短，适于大规模生产蛋白的工业应用等优点[17]。虽然大肠杆菌也可以在细胞周质中表达重组蛋白并将其分泌，但其分泌特性远不如枯草芽孢杆菌[17]。有文献报道克隆出地衣芽孢杆菌DSM13中的β-甘露聚糖酶基因，并将其在大肠杆菌中表达[16]。但是大部分重组蛋白都在细胞周质中，只有一小部分可以在培养液中检测到。我们成功地将甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中表达，并且在培养液上清中检测到了大部分重组蛋白(约占所有重组蛋白的94％)。影响重组蛋白表达水平主要有以下几个因素：转录效率，mRNA稳定性，翻译的效率和蛋白的稳定性。枯草芽孢杆菌表达的甘露聚糖酶酶活远小于大肠杆菌中表达的甘露聚糖酶。这可能是由于重组蛋白的折叠不正确或枯草芽孢杆菌释放的外源蛋白可以识别并降解异源蛋白。 总结本研究的工作，从臭豆腐卤液中富集得到六个菌株，并将其中具有强甘露聚糖酶代谢能力的菌株(短小芽孢杆菌Nsic-2)分离，从中克隆出甘露聚糖酶基因，将其成功地在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达。还将甘露聚糖酶纯化，研究了纯酶的酶学性质。与其它甘露聚糖酶相比，ManB在pH6.0-9.0的条件下酶活稳定。ManB在碱性条件下的稳定性使得其在很多工业中表现出潜在的应用价值。未来我们将会把研究重点放在其用于纸浆工业中的应用，并研究其功能与结构之间的关系。除此之外，还会进一步优化manB在枯草芽孢杆菌中的表达策略。